生物打印人体胶质母细胞瘤芯片以鉴定患者对放化疗的特异性反应

胶质母细胞瘤（GBM）是最常见的脑瘤，约占所有原发性恶性脑瘤的50%，具有很高的致死率。为了给患者制定一套有效的治疗方案，建立患者特定的癌症模型是一种可靠的临床决策选择。病人来源的肿瘤异种移植动物模型已被证明能很好地再现亲代肿瘤的特征，但由于建立肿瘤模型所需的时间长、成功率低、成本高和伦理问题，它们在临床上的试验受到了阻碍。而建立反映父代癌症原始信息的体外肿瘤模型可以克服这些不利因素。目前，体外肿瘤模型在建立一个包括细胞和分子多样性以及肿瘤的生化和生物物理信号的生理相关系统方面仍然存在一定的局限性。

因此，Sun Ha Paek和Dong-Woo Cho团队提出了一种制作具有高度仿生生态系统的体外肿瘤模型的方法-GBM芯片。该GBM芯片通过生物3D打印来自患者来源的肿瘤细胞（GBM）、血管内皮细胞（HUVECs）的生物墨水（BdECM）制作。经过后续的实验探究，该芯片的高度异质性促成了GBM各种病理特征的出现，与临床结果相匹配。并且患者特异性的GBM芯片模型可用于试验优越肿瘤杀伤相关的药物组合，可能有助于确定对标准治疗胶质母细胞瘤药物耐药的患者的有效治疗方法。

近期发表在Nature Biomedical Engineering杂志上题为”A bioprinted human-glioblastoma-on-a-chipfor the identification of patient-specific responses to chemoradiotherapy”的文章，来自首尔国立大学的Sun Ha Paek和Dong-Woo Cho团队。

图1 用于为病人识别最佳药物组合的专用GBM芯片的生物打印和使用示意图。

为了打印GBM模型芯片，研究团队首先开发了一种猪脑脱细胞化的生物墨水（BdECM）。生物墨水在打印时起到保护细胞的封装载体作用，并在沉积后凝固成为细胞支撑基质。为了评估这种生物墨水在促进GBM细胞恶性增殖方面的潜力，将其与常用的胶原凝胶进行对比。团队成员将GBM细胞进行水凝胶包埋培养，以模拟细胞在三维生物打印过程后以胶囊形式生长。最终结果表明，BdECM中具有更加优越的细胞增值率、相关基因的高表达以及纺锤状的细胞形态（图2）。

图2 BdECM生物墨水的制备与评价

然后，根据GBM的生态学特征【GBM以高度致密的球形生长，沿氧梯度形成解剖上不同的区域（核心、中间和外围）。核心区中的癌细胞经历严重的缺氧，并形成假透明带的坏死区。在中间区，间变性细胞过度增殖，分泌多种细胞因子以维持生存。结果，肿瘤周围区域出现微血管浸润和增生】，打印GBM芯片。芯片的制作过程如下（辅助视频1）：（1）在非渗透性玻璃基板上用可渗透硅树脂墨水打印腔室壁；（2）为了构建GBM模拟结构，首先将填充HUVECs的BdECM生物墨水打印成环状；（3）然后打印含有GBM细胞的BdECM生物油墨，填充BdECM-HUVEC环结构的内部，（4）将整个打印结构固化在加湿细胞培养箱中，然后用玻璃盖片覆盖腔室顶部（图3）。另外，通过有限元分析计算结合免疫荧光染色法实验，表征了芯片的氧梯度。

图3 GBM芯片打印原理以及生态学表征

由于芯片上的GBM同时捕获了原始癌症环境的三个关键特性：生化特征（类似于脑ECM的微环境）和两个物理特征（癌性肿块的分隔结构，血管化基质和氧梯度）。通过比较不同的环境特征组合即单元类型（SF+,SF-）、氧梯度(GR+,GR-)，我们评估了这些特性对GBM病理生理学重述的影响（图4）。通过实验表征，SP+ GR+条件（单元化结构、存在氧梯度）比其他条件更能反映肿瘤的重要病理学特征，包括缺氧诱导的坏死核、假栅栏、细胞类型的空间异质性和血管周围微环境。这些数据再次支持了BdECM，氧梯度和分隔的组织结构的协同效应对于概括原始GBM病理生理的重要性。

图4 生化和生物物理异质性对芯片上GBM病理进展的协同效应。

接下来，团队成员利用GBM芯片再现了GBM患者由于药物抵抗力差异所导致的差异性临床治疗结果的现象。患者在经过同步放化疗（CCRT）加替莫唑胺（TMZ）【标准治疗疗程】治疗后的不同结果分为3组，即X组患者（a、b和c）表现出低到中等的治疗抵抗力，存活时间>2年；Y组患者（d和e）表现出高的治疗抵抗力，存活时间<1年，Z组患者（f组和g组）在CCRT后经历了恶性肿瘤。鉴于这些临床结果，利用上述患者来源的GBM细胞制成上述芯片，经过单次CCRT和TMZ治疗。有趣的是，X组芯片上的GBM-15、-26和-278细胞的存活率低于其他组，而Z组芯片上的GBM-28、-37、-51和-103细胞的存活率显著高于其他组（图5），单次治疗后从芯片上GBMs获得的存活率百分比的顺序为X

图5 患者特异性GBM芯片治疗耐药性差异的临床再现

最后，团队成员研究了GBM芯片针对特定患者的药物组合效果评价。由于患者c在接受CCRT后病情意外恶化，利用该芯片筛选几种候选药物组合治疗效果（图6），并以此确定了相对最佳的治疗方案。

图6 评估单个患者对用不同的药物组合配合CCRT治疗的敏感性